Уредио Петер Сарнов, Медицински факултет Универзитета Станфорд, Универзитет Станфорд, Калифорнија, одобрено 25. децембра 2020. (прегледано 25. октобра 2020.)
Извештавамо о интеракцији између подјединица у репликацији корона вируса-транскрипционих комплекса, који су неопходни за репликацију и еволуциону конзервацију.Дали смо доказе да домен НиРАН повезан са нсп12 има активност нуклеозид монофосфата (НМП) трансферазе у транс и идентификовали нсп9 (протеин који се везује за РНК) као своју мету.НиРАН катализује ковалентно везивање НМП остатка за конзервирани нсп9 амино терминус у реакцији која се ослања на Мн2+ јоне и суседне конзервиране Асн остатке.Утврђено је да су активност НиРАН-а и нсп9 НМПилација од суштинског значаја за репликацију коронавируса.Подаци нам омогућавају да повежемо ову активност угнежђеног вирусног ензима маркера са претходним запажањима у хипотези да је иницијација синтезе РНК у класи РНК вируса функционално и еволутивно конзистентна.
РНК-зависна РНК полимераза (РдРпс) из Нидовиралес (Цоронавиридае, Артериовиридае и 12 других породица) је повезана са амино-терминалним (Н-терминалним) доменом у неструктурном протеину (нсп) ослобођеном из полипротеина, званом НиРАН 1аб се састоји од вирусне главне протеазе (Мпро).Раније је пријављена сопствена ГМПилација/УМПилација артеријског вируса НиРАН-РдРп нсп и предложено је да се генерише пролазни процес за трансфер нуклеозид монофосфата (НМП) у (тренутно непознате) вирусе и/или ствари за биополимеризацију ћелија.Овде показујемо да коронавирус (Хуман Цоронавирус [ХЦоВ]-229Е и Тешки акутни респираторни синдром Цоронавирус 2) нсп12 (НиРАН-РдРп) има активност НМПилације зависну од Мн2+, која је изведена из нсп9 кроз формирање Мпро посредованог нсп9 након Н-терминални бочни нспс се протеолитички ослобађа, фосфорамидат је везан за примарни амин (Н3825) на Н-терминалу нсп9.Уридин трифосфат је пожељни нуклеотид у овој реакцији, али аденозин трифосфат, гванозин трифосфат и цитидин трифосфат су такође погодни косупстрати.Студије мутација коришћењем рекомбинантних протеина коронавируса нсп9 и нсп12 и генетски модификованих мутаната ХЦоВ-229Е одредиле су остатке неопходне за НиРАН посредовану нсп9 НМПилацију и репликацију вируса у ћелијској култури.Подаци су потврдили предвиђање остатака активног места НиРАН и утврдили важну улогу нсп9 Н3826 остатака у нсп9 НМПилацији и репликацији вируса ин витро.Овај остатак је део очуване Н-терминалне ННЕ трипептидне секвенце и показао се као једини непроменљиви остатак нсп9 и његових хомолога у породици коронавируса.Ова студија пружа солидну основу за функционално проучавање активности НМПилације других угнежђених вируса и предлаже могуће циљеве за развој антивирусних лекова.
Нидовиралес позитивно-ланчани РНК вирус инфицира различите кичмењаке и бескичмењаке (1, 2).Редослед тренутно обухвата 14 породица (3), од којих је породица Корона вируса детаљно проучавана у последњих 20 година.У то време, три зооноза корона вируса изашла су из животињских домаћина и изазвала велике епидемије тешких респираторних инфекција код људи.Укључујући упорне пандемије изазване тешким акутним заразним болестима.Респираторни синдром Коронавирус 2 (САРС-ЦоВ-2) (4ааа7).Нидовируси деле заједничку организацију генома, а подјединица комплекса репликације-транскрипције везаног за мембрану (РТЦ) је кодирана у 5-?²-терминалној две трећине и главној структурној подјединици вирусне честице, као и у неким додацима .Протеин, кодиран у 3??² крајњој трећини генома (1).Осим једне породице планарних вируса (Моновиридае) (8), сви угнежђени вируси кодирају РТЦ подјединице у два велика отворена оквира читања (ОРФ) ОРФ1а и ОРФ1б, који су преведени из геномске РНК.ОРФ1а кодира полипротеин (пп) 1а, а ОРФ1а и ОРФ1б заједно кодирају пп1аб.Уз опште учешће главне протеазе (Мпро) коју кодира ОРФ1а, и пп1а и пп1аб се протеолитички обрађују у различите неструктурне протеине (нспс), такође познате као 3ЦЛпро, јер има хомологију са 3Цпро пикорнавируса ( 9).Сматра се да су ови нспс састављени у велики динамички РТЦ, катализују синтезу геномске РНК (репликација) и скупа субгеномске РНК (транскрипција) и користе се за координацију експресије ОРФ који се налази низводно од ОРФ1б (10?? ?12).
Језгро РТЦ укључује РНК зависну РНК полимеразу (РдРп) (13), хеликазу суперфамилије 1 (ХЕЛ1) (14, 15) и неколико ензима за обраду РНК, који су углавном кодирани у ОРФ1б и у породици коронавируса. Садржи нсп12-нсп16 и нсп9-нсп12 у породици Артериовиридае (види референцу 10-12).РдРп и ХЕЛ1 представљају два (једна петина) очувана домена вируса птичјег гнезда и имају хомологију међу осталим РНК вирусима.Верује се да језгра репликазе потпомогнута другим подјединицама, укључујући неколико малих нспс ослобођених из карбокси-терминалног (Ц-терминалног) региона пп1а, низводно од Мпро (коронавирус нсп5 и артеријски вирус нсп4, респективно).Имају ограничену заштиту специфичну за породицу и различите активности (прегледано у референци 10–12).
Релативно недавно, домен са јединственим карактеристикама мотива секвенце пронађен је на амино терминусу (Н-терминусу) поред РдРп-а код свих угнежђених вируса, али не и код других РНК вируса (16).На основу његове локације и активности нуклеотидне трансферазе (нуклеозид монофосфат [НМП] трансферазе), овај домен је назван НиРАН (Нествирус РдРп-релатед нуцлеотиде трансферасе).Дводоменска комбинација НиРАН-РдРп чини нсп12 у породици Цоронавиридае и нсп9 у породици Артериовиридае, а код других нестовиридае, очекује се да ће се НиРАН-РдРп ослободити као независни нсп из вирусног полипротеина.Код коронавируса, НиРАН домен садржи ??1/450 остатака и повезан је са Ц-терминалним РдРп доменом преко региона линкера (16?19).Код Екуине Артеритис Вирус (ЕАВ) (Артеривиридае), рекомбинантни нсп9 показује активности УМПилације и ГМПилације зависне од Мн2+ јона (само) које зависе од три очуване базе секвенце у нестовирусу, АН, БН и ЦН, остаци у секвенци.Где Н означава НиРАН) (16).Н-терминални бочни део ових мотива је мање конзервативан мотив преАН.Неки од ових остатака су такође сачувани у далеко сродним протеин киназама, где се показало да су укључени у везивање нуклеозид трифосфата (НТП) и каталитичку активност (20, 21).У складу са овим запажањем, неколико кључних остатака активног места у псеудокинази СелО из Псеудомонас сирингае може се саставити са недавно објављеним суперкомплексом САРС-ЦоВ-2 нсп7/8/12/13.Конзервирани остаци НиРАН корона вируса који се налазе у електронској микроструктури.Рекомбинантни протеин (17).Спекулише се да ће документована (самостална) У/ГМПилација произвести пролазно стање за пренос НМП на (тренутно непознати) супстрат (16), а структурна сличност између НиРАН и протеин киназе (17, 19) ) Да ли је хипотеза да НиРАН модификује друге протеине.
Многе карактеристике, укључујући његову јединствену и јединствену систематску повезаност са угнежђеним вирусима и генетско одвајање од РдРп-а, чине НиРАН разумним кључним регулаторним ензимом за угнежђене вирусе, што је кључно за њихов настанак и идентитет.Раније су називане три могуће функције које укључују НиРАН за регулисање генома/субгеномског превођења или репликације/транскрипције.Узимајући у обзир оскудне и непотпуне податке који су били доступни у то време, свака функција има своје предности и недостатке (16).У овом истраживању, циљ нам је да комбинујемо биохемијске и реверзне генетске студије о коронавирусима који представљају два рода, и ставимо наше налазе у еволуциону позадину природне мутације породице коронавируса, како бисмо стекли увид у ово Мистериозно царство.Извјештавамо о великом напретку у разумијевању НиРАН-а кроз идентификацију природних мета у РТЦ-у, што (међу три доступне хипотезе) доприноси улози овог домена у покретању синтезе угнијежђене вирусне РНК.Ово истраживање такође отвара могућности за друге улоге НиРАН-а на интерфејсу хоста вируса.
Да бисмо окарактерисали ензимска својства НиРАН домена повезаног са вирусом корона нсп12, произвели смо рекомбинантни облик хуманог коронавируса 229Е (ХЦоВ-229Е) нсп12 у Е. цоли, са Хис6 ознаком на Ц-терминусу, и комбиновали протеин са [α32-П ] Инкубирајте заједно са НТП у присуству МнЦл2 као што је описано у Материјалима и методама.Анализа продукта реакције указала је на присуство радиоактивно обележеног протеина који заједно мигрира са нсп12 (106 кДа), што указује да коронавирус нсп12 катализује формирање ковалентних протеина-НМП адуката, првенствено формираних са уридин монофосфатом (УМП) (Слика 1А) и Б).Квантитативна анализа је показала да се у поређењу са другим нуклеотидима, интензитет сигнала инкорпорације УМП повећао за 2 до 3 пута (слика 1Ц).Ови подаци су у складу са предвиђеном активношћу НМП трансферазе НиРАН домена коронавируса (16), али указују на то да су нуклеотидне преференције НиРАН домена коронавируса и артеријског вируса различите.
Само-НМПилациона активност ХЦоВ-229Е нсп12.(А) ХЦоВ-229Е нсп12-Хис6 (106 кДа) је инкубиран са означеним [α-32П] НТП у присуству 6 мМ МнЦл2 током 30 минута (погледајте материјале и методе за детаље).Реакциони производи су раздвојени помоћу СДС-ПАГЕ и обојени Цоомассие бриљантно плавим.(Б) Радиоактивно обележени протеин се визуализује помоћу сликања фосфора.Положаји нсп12-Хис6 и маркера молекулске масе протеина (у килодалтонима) приказани су у А и Б. (Ц) Интензитет радиоактивног сигнала (средња вредност ± СЕМ) одређен је из три независна експеримента.*П≤0,05.Јачина сигнала (проценат) је повезана са УТП.
Иако се показало да су активности ензима повезане са НиРАН-ом кључне за репликацију ЕАВ-а и САРС-ЦоВ у ћелијској култури (16), специфична функција НиРАН-а и потенцијални циљеви још нису утврђени.Недавно пријављена структурна сличност између НиРАН-а и породице протеина са наборима сличним протеин кинази (17, 22) подстакла нас је да тестирамо хипотезу да НиРАН катализује НМПилацију других протеина.Генерисали смо скуп потенцијалних хомологних мета, укључујући неструктурне протеине кодиране ХЦоВ-229Е ОРФ1а (нспс 5, 7, 8, 9, 10), од којих свака садржи Ц-терминалну Хис6 ознаку (СИ додатак, Табела С1) и инкубирајте ове протеине са [α32-П] уридин трифосфатом ([α32-П]УТП) у присуству или одсуству нсп12.Говеђи серумски албумин и фузиони протеин МБП-ЛацЗα произведен у Е. цоли служили су као контроле (Слика 2А, траке 1 до 7).Радиоактивно обележени протеин је анализиран електрофорезом натријум додецил сулфат-полиакриламид гела (СДС-ПАГЕ) и ауторадиографијом и установљено је да постоји јак радиоактивни сигнал у реакцији која садржи нсп12 и нсп9.Положај сигнала одговара молекулској маси нсп9, што указује на УМПилацију нсп9 посредовану нсп12 (слика 2Б, стаза 7).Није пронађен ниједан други тест протеин да је УМПилован, што нас је довело до закључка да је нсп9 специфичан супстрат за нсп12.У складу са подацима о само-НМПилацији приказаним на слици 1, нсп12 је у стању да пренесе сва четири НМП на нсп9, иако је ефикасност различита, УМП> аденозин монофосфат (АМП)> гванозин монофосфат (ГМП)> цитидин монофосфат (ЦМП) ) ( Слика).3 А и Б).Под условима коришћеним у овом тесту (скратити време реакције и излагања, смањити концентрацију нсп12; материјали и методе), само-НМПилација нсп12 није могла бити откривена (упоредите Слику 2Б, траку 7 и Слику 1Б), што показао се ефикасним (и више рунди) УМП је прешао са нсп12 на нсп9.Активност УМП трансферазе захтева присуство Мн2+ јона, као што је приказано на слици 3Ц, док је само минимална активност УМП трансферазе примећена у присуству Мг2+, а никаква активност у присуству друга два тестирана двовалентна катјона.Слични подаци су добијени у НМПилационим тестовима који садрже цитидин трифосфат (ЦТП), гванозин трифосфат (ГТП) и аденозин трифосфат (АТП) (СИ додатак, слика С1).
УМПилација нсп9 посредована ХЦоВ-229Е нсп12.Серија протеинских супстрата (укључујући говеђи серумски албумин, МБП-лацЗα и низ ХЦоВ-229Е нспс означених са Ц-терминалом Хис6 кодираног са ОРФ1а) је коришћена за процену УМПилационе активности ХЦоВ-229Е нсп12-Хис6⁺-медија беланчевина.Инкубирајте протеин са [α-32П] УТП 10 минута у одсуству (А) или присуству (Б) нсп12 као што је описано у материјалима и методама.На врху А и Б приказан је СДС-полиакриламидни гел обојен Цоомассие Бриллиант Блуе, а на дну А и Б приказани су одговарајући ауторадиограми.Положај маркера молекулске масе протеина (у килодалтонима) је дат са леве стране.Положај нсп12-Хис6 (Б, врх) и радиоактивни сигнал примећен током инкубације нсп12-Хис6 са нсп9-Хис6 (Б, трака 7) такође су назначени, што указује да [α-32П]УМП за нсп9-Хис6 (12,9 кДа), што није примећено за друге тестиране протеине.
ХЦоВ-229Е НиРАН-посредована биохемијска и виролошка карактеризација НМПилације нсп9.(А и Б) Улога нуклеотидног косупстрата који се користи у реакцији.Нсп12-Хис6 и нсп9-Хис6 се мешају и инкубирају у присуству различитих [α-32П] НТП-ова у стандардном тесту НМПилације.(А, врх) Цоомассие обојен нсп9-Хис6 одвојен СДС-ПАГЕ.(А, доле) Ауторадиограм исте области гела.(Б) Релативна активност (средња вредност ± СЕМ) у присуству назначеног нуклеотидног кофактора одређена је из три независна експеримента.*П≤0,05.(Ц) Улога металних јона.Приказан је стандардни НМПилациони тест у присуству [α-32П] УТП и различитих металних јона, сваки са концентрацијом од 1 мМ.У Ц, на врху, приказан је Цоомассие обојен нсп9-Хис6, а у Ц, на дну, приказана је одговарајућа ауторадиографија.Величина обележеног протеина (у килодалтонима) је приказана лево од А и Ц. (Д) Мутантни облик ХЦоВ-229Е нсп12-Хис6 који носи наведену супституцију амино киселина налази се у [α-32П]УТП, као што је описано у материјалима и методама.Радиоактивно обележени нсп9-Хис6 произведен у реакцији НМПилације детектује се фосфорилационим имиџингом (Д, врх).Релативна активност у поређењу са дивљим типом (вт) протеина је приказана у Д, а дно је узето као просек (±СЕМ) из три независна експеримента.Звездице означавају замене неконзервираних остатака.(Е) Титар вируса у супернатанту културе п1 ћелија добијен 24 сата након инфекције одређен је тестом плака.Назначене су супституције кодона у домену НиРАН конструисаног ХЦоВ-229Е мутанта (нумерација остатака је заснована на њиховој позицији у пп1аб).Као контрола је коришћен мутант РдРп активног места са недостатком репликације нсп12_ДД4823/4АА.
Да бисмо стекли дубље разумевање активног места НиРАН-а и одредили остатке везане за активност НМП трансферазе специфичне за нсп9, извршили смо анализу мутација, у којој смо заменили конзервативне остатке у НиРАН АН, БН и ЦН мотивима ( 16) То је Ала (СИ додатак, слика С2).Поред тога, утицај конзервативних супституција Арг-то-Лис или Лис-то-Арг је процењен у два случаја.Као (негативна) контрола, остаци који нису или су мање очувани у НиРАН домену коронавируса и других угнежђених вируса замењени су са Ала. Замена К4116А (у мотиву преАН), К4135А (АН), Р4178А (БН), Д4188А (мотив БН) и Д4280А (ЦН) значајно смањују или чак елиминишу нсп9 НМПилацију преко нсп12, док протеини са конзервативним супституцијама (Р4178К), К4116Р) задржавају 60% и 80% своје активности, што указује да је релаксација ограничења на њиховој страни ланци је физичко-хемијски осетљив (слика 3Д).Замена неколико других конзервираних остатака Е4145А, Д4273А, Ф4281А и Д4283А је много мање штетна, а нсп9 УМПилација је само умерено смањена.Слични резултати су добијени у реакцијама нсп9 НМПилације које укључују друге НТП (слика 3Д и СИ додатак, слика С3), потврђујући да су уочени ефекти на специфичне аминокиселинске супституције независни од типа коришћеног нуклеотидног косупстрата.Затим смо тестирали могући утицај ових супституција нсп12 на репликацију коронавируса у ћелијској култури.У ту сврху, користили смо одговарајуће генетски модификоване комплементарне ДНК (цДНК) шаблоне клониране у рекомбинантном вирусу вакциније (23, 24) да транскрибујемо 5-7 ћелија.Титрација потомства инфективног вируса произведеног у овим ћелијама показала је да већина ХЦоВ-229Е НиРАН мутаната није изводљива (слика 3Е).Група неодрживих вирусних мутаната укључује алтернативе за које се показало да елиминишу или значајно смањују активност НМП трансферазе ин витро (К4116А, К4135А, Р4178А, Д4188А, Д4280А, Д4283А), али постоје две друге алтернативе (К4116Р, Е41045А) % резервисано?Њихова ин витро активност НМПилације сугерише да су укључена додатна ограничења.Слично, две друге мутације (Р4178К, Ф4281А) које су изазвале умерено смањење активности НиРАН ин витро НМПилације произвеле су живе вирусе, међутим, ови вируси су значајно смањили титре репликације.У складу са подацима о активности ин витро приказаним на слици 3Д, заменом четири друга остатка који нису сачувани у коронавирусу и/или другим угнежђеним вирусима (К4113А, Д4180А, Д4197А, Д4273А) (8, 16) су произвели одрживи вируси. Потомство, упркос томе што је имало умерено смањен титар у поређењу са вирусом дивљег типа (Слика 3Е).
Да би се испитало да ли активност НМП трансферазе посредована НиРАНом зависи од активног РдРп домена, два конзервирана Асп остатка укључена у координацију јона двовалентних метала (11) у РдРп мотиву Ц замењена су Ала. Добијени протеин нсп12_ДД4823/4АА задржава његова нсп9 НМПилациона активност, што указује да нсп12 посредована ин витро активност нсп9 НМПилације не захтева активност полимеразе (СИ Додатак, Слика С4).
Након утврђивања активности НМП трансферазе специфичне за нсп9 за нсп12, покушали смо да окарактеришемо адукт НМП-нсп9 помоћу масене спектрометрије (МС).Комплетан спектар масе протеина рекомбинантног ХЦоВ-229Е нсп9 показао је максимум на 12.045 Да (Слика 4А).Додавање нсп12 није променило квалитет нсп9, што указује да нсп12 и нсп9 не би формирали стабилан комплекс у коришћеним условима (денатурација) (слика 4А).У присуству УТП-а и ГТП-а, мерење масе реакције која садржи нсп9 и нсп12 показало је да се протеинска маса УТП-а померила за 306 Да, а протеинска маса ГТП-а 345 Да, што указује да сваки молекул нсп9 везује УМП или ГМП (Слика 4) Ц и Д).Спекулише се да енергија потребна за НиРАН посредовану нсп9 НМПилацију потиче од хидролизе НТП и ослобађања пирофосфата.Иако је 10-струки моларни вишак нсп9 (циља) у односу на нсп12 (ензим) коришћен у овој реакцији, примећена је скоро потпуна НМПилација нсп9, што указује да је интеракција између нсп12 и нсп9 краткотрајна и да нсп12 може НМПилирати више нсп9 ин витро молекул.
Појединачна НМПилација нсп9 у присуству нсп12 и УТП или ГТП.Приказан је деконволутивни спектар масе протеина ХЦоВ-229Е нсп9 (СИ додатак, Табела С1) (АД).(А) сам нсп9, (Б) нсп9 + нсп12-Хис6, (Ц) нсп9 + нсп12-Хис6 у присуству УТП, (Д) нсп9 + нсп12-Хис6 у присуству ГТП.
Да би се одредили остаци нсп9 УМПиловани са нсп12, нсп9-УМП је цепан трипсином.Добијени пептиди су раздвојени течном хроматографијом високих перформанси (ХПЛЦ) и анализирани тандем масеном спектрометријом (МС/МС) онлајн.Анализа података коришћењем софтверског пакета Биониц (Протеин Метрицс) показала је УМПилацију Н-терминалне амино киселине.Ово се потврђује ручно.Тандем масени спектар прекурсора пептида [УМП]ННЕИМПГК (СИ додатак, слика С5А) открио је фрагмент при 421 м/з, што указује да се УМП везује за остатак 1 нсп9.
На Н-крају нсп9, Асн је сачуван међу члановима Ортхоцоронавиринае (СИ додатак, слика С6).Иако верујемо да је примарни амински азот Н-терминала највероватнији акцептор за УМП, одлучили смо да добијемо додатне доказе о везивању НМП-а на Н-терминалу.Из тог разлога, не-НМПиловани и НМПиловани Н-терминални пептид нсп9 пречишћен ХПЛЦ-ом је изведен у присуству ацетона и натријум цијаноборхидрида.Под овим условима, само слободни примарни амини могу бити модификовани пропилом (25).Н-терминални пептид изведен из нсп9 са секвенцом ННЕИМПГК садржи два примарна амина, један на Н-терминусу Асн и други на бочном ланцу Лис на Ц-терминусу.Због тога се пропил групе могу увести на оба краја.Екстраховани јонски хроматограми не-НМПилираних пептида приказани су у СИ додатку, слика С5Б.Као што се очекивало, могу се идентификовати Н-терминални и Ц-терминални (моно)пропиловани (СИ додатак, слика С5Б, горња трака) и дипропиловани пептиди (СИ додатак, слика С5Б, доња трака).Овај образац се мења употребом НМПилираног Н-терминалног пептида нсп9.У овом случају, могу се идентификовати само пропиловани пептиди са Ц-терминала, али Н-терминални пропиловани пептиди и дипропиловани пептиди нису идентификовани (СИ додатак, слика С5Ц), што указује да је УМП пребачен на Н-терминални примарни амин да би се ово спречило група од уношења промена.
Затим, замењујемо (са Ала или Сер) или бришемо очуване остатке на Н-крају нсп9 да бисмо дефинисали ограничења специфична за циљ.На основу наших МС података који показују да НиРАН формира нсп9-НМП адукт са примарним амином Н-терминалног остатка нсп9, претпоставили смо да нсп9 НМПилација захтева вирусну главну протеазу (Мпро, нсп5) да ослободи Н-терминал нсп9 из његов полипротеински прекурсор.Да бисмо тестирали ову хипотезу, произвели смо прекурсорски протеин нсп7-11 који садржи нсп9 у Е. цоли и извршили стандардни тест НМПилације у присуству [α-32П] УТП (материјали и методе).Као што је приказано на слици 5А (трака 3), непресечени прекурсор нсп7-11 није радиоактивно обележен са нсп12.Насупрот томе, ако се нсп7-11 цепа рекомбинантним нсп5 да би ослободио нсп9 (и друге нспс) из прекурсора, детектује се радиообележени протеин који мигрира са нсп9, потврђујући наш закључак да НиРАН и Н-селективно формирање ковалентних нсп9-НМП адуката .Терминални примарни амин Н-терминалног Асн (позиција 3825 у пп1а/пп1аб).Овај закључак је такође подржан експериментима који користе нсп9 конструкт, који садржи један или два додатна остатка на Н-терминусу.У оба случаја, НиРАН посредована УМПилација нсп9 је укинута (СИ додатак, слика С7).Затим смо произвели протеин са једним или два Асн остатка избрисаним из 3825-ННЕИМПК-3832 пептидне секвенце на Н-терминалу нсп9.У оба случаја, нсп9 УМПилација је потпуно блокирана (Слика 5Б), пружајући додатни доказ да прави нсп9 Н-терминус делује као НМП рецептор.
Протеолитичка обрада нсп9 и улога Н-терминалних остатака у УМПилацији посредованој нсп12.(А) нсп9 УМПилација захтева слободан нсп9 Н-терминал.Нсп7-11-Хис6 је претходно инкубиран на 30 °Ц у пуферу за детекцију НМПилације који садржи УТП у присуству или одсуству рекомбинантног Мпро (нсп5-Хис6).После 3 сата, започните тест НМПилације додавањем нсп12-Хис6 као што је описано у Материјалима и методама.Реакција која садржи нсп5-Хис6 (трака 1) и нсп9-Хис6 (трака 2) је коришћена као контрола.После 10 минута, реакција је прекинута и реакциона смеша је одвојена помоћу СДС-ПАГЕ.Протеин је обојен Цоомассие Бриллиант Блуе (А, врх).Прекурсор Нсп7-11-Хис6 и обрађени производ који је резултат цепања посредованог нсп5-Хис6 приказани су на десној страни.Имајте на уму (због њихове мале величине) да се нсп7 и нсп11-Хис6 не могу детектовати у овом гелу, а реакција је допуњена са нсп5-Хис6 (траке 1 и 4; позиција нсп5-Хис6 је означена пуним кругом) или нсп9-Хис6 (Трака 2) садржи малу количину МБП (означено отвореним круговима) као заостале нечистоће јер су изражене као МБП фузиони протеини (СИ додатак, Табела С1).(Б) Варијанта Нсп9-Хис6 нема један или два Н-терминална Асн остатка (нумерисање остатака према положају у пп1а/пп1аб) и пречишћена је и инкубирана са нсп12-Хис6 и [α-32П] УТП.Б, СДС-ПАГЕ обојен Цоомассие-ом је приказан на врху, Б, одговарајући ауторадиограф је приказан на дну.Положај маркера молекулске тежине (у килодалтонима) је приказан на левој страни.(Ц) ХЦоВ-229Е нсп9-Хис6 Н-терминални конзервирани остаци су замењени са Ала или Сер, а иста количина протеина је коришћена у реакцији УМПилације посредоване нсп12-Хис6.Реакциони производи су раздвојени помоћу СДС-ПАГЕ и обојени са Цоомассие Бриллиант Блуе (Ц, врх), а радиоактивно обележени нсп9-Хис6 је детектован фосфоресцентним снимањем (Ц, средина).Користећи протеин дивљег типа (тежински) као референцу (подешен на 100%), релативна активност НМПилације (средња вредност ± СЕМ) је израчуната из три независна експеримента.(Д) Титри вируса у супернатанту п1 ћелијске културе ћелија Хух-7 инфицираних са ХЦоВ-229Е дивљег типа Хух-7 ћелија, и мутанти који носе одређене аминокиселинске супституције у нсп9 су одређени тестом плака.Као негативна контрола коришћен је РдРп мотив са недостатком репликације двоструки мутант ДД4823/4АА.
Н-терминус нсп9 (посебно позиције 1, 2, 3 и 6) је веома очуван међу члановима подфамилије Ортхоцоронавиринае (СИ додатак, слика С6).Да би се проучила могућа улога ових остатака у нсп12 посредованој нсп9 НМПилацији, два узастопна Асн остатка на Н-терминусу нсп9 замењена су са Ала или Сер (сам или у комбинацији).У поређењу са дивљим типом нсп9, замена Н3825 са Ала или Сер резултирала је више него двоструко смањењем УМПилације посредоване нсп12 (слика 5Ц).У складу са нашим закључком да се НМПилација јавља на Н-терминалном примарном амину уместо на бочном ланцу Н-терминалног остатка, приметили смо значајну резидуалну НМПилацију са заменом Н3825А и Н3825С.Занимљиво је да ако се други Асн замени Ала или Сер, нсп9 УМПилација се јаче смањује (више од 10 пута), док замена Ала на позицијама 3, 4 и 6 има само умерен ефекат на нсп9 УМПилацију (Слика 2 ) .5Ц).Слични резултати су добијени коришћењем АТП, ЦТП или ГТП (СИ додатак, слика С8).Заједно, ови подаци указују на кључну улогу Н2826 (позиција 2 у нсп9) у нсп9 НМПилацији.
Да бисмо добили додатне доказе о функционалној корелацији између Н-терминуса нсп9 и НМПилације, извршили смо вишеструко поравнање секвенци (МСА) нсп9 секвенце породице Цоронавируса (која варира између 104 и 113 остатака) (СИ додатак, слика С6).Укупно, у 47 (познатих и претпостављених) врста од 5 родова подфамилије Ортхоцоронавиринае које инфицирају различите сисаре, птице и домаћине рептила, утврђено је да је само 8 остатака непроменљиво.Најобимније промене, укључујући делеције и инсерције, примећене су у циклусима између елемената секундарне структуре нсп9, како је утврђено претходним структурним студијама (26 ??28).Пет инваријантних остатака пронађено је у β ланцу и α хеликсу Ц-терминалног дела нсп9.Три инваријантна остатка чине ННЕ мотив Н краја нсп9.Откривено је да је други Асн овог мотива једини инваријантни остатак, који такође дели хипотетички нсп9 удаљеног корона вируса жабе, и представља врсту Мицрохила летовирус 1 у потфамилији Летовиринае оф Алпхалетовирус.Очување остатака у елементима секундарне структуре нсп9 може се рационализовати структурним разматрањима да би се одржала савијања или позната својства везивања РНК.Међутим, изгледа да се ово резоновање не односи на очување ННЕ, а пре ове студије, природа ограничења која ограничавају варијацију трипептидне секвенце била је потпуно затамњена.
Да бисмо утврдили важност нсп9-НМПилације и ННЕ очувања у репликацији коронавируса, произвели смо мутанте ХЦоВ-229Е, који носе једноструке или двоструке супституције нсп9 Н-терминалних остатака, што указује да је нсп9 НМПилација штетна ин витро.Пре него што почнемо, покушавамо да одговоримо на питање да ли ове замене (у близини места цепања нсп8|9) утичу на протеолитичку обраду Ц-терминалног пп1а региона.Скуп нсп7-11 полипротеинских конструката који садрже одговарајуће супституције на Н-терминусу нсп9 произведен је у Е. цоли и исечен рекомбинантним Мпро.Протеолитичко цепање четири места (укључујући нсп9 бочно место) није значајно под утицајем било каквих уведених супституција (СИ додатак, слика С9), искључујући структурне промене у овим протеинима које ометају Мпро-посредовано цепање нсп8|9 (или друго) веб сајт.
Хух-7 ћелије су трансфектоване са ХЦоВ-229Е РНК дужине генома, које кодирају Ала или Сер супституције у очуваним ННЕ трипептидима (Н3825, Н3826 и Е3827) на нсп9 Н терминусу, показујући да је већина мутација фатална.Успели смо да спасимо вирус заменом Сер или Ала Н-терминалног Асн (Н2835А или Н2835С), али нисмо успели да повратимо вирус другим појединачним и двоструким мутацијама у ННЕ секвенци (Н3826А, Н3826С, НН3825/6АА, НН3825/6СС) , Е3827А) (Слика 5Д).
Ови резултати указују на то да је репликација коронавируса у култури ткива ограничена (иста или слична), ограничавајући природну мутацију нсп9 НМПилационих места у телу и подржавајући кључну улогу овог одговора у животном циклусу коронавируса.
У последњем сету експеримената, произвели смо Ц-терминални Хис6 са ознаком САРС-ЦоВ-2 нсп12 и нсп9, и два мутантна облика нсп12 у Е. цоли.Остаци активног места у доменима НиРАН и РдРп су уместо њих користили Ала (Слика 6А и СИ додатак, Табела С2).К4465 у САРС-ЦоВ-2 нсп12 одговара К4135 у ХЦоВ-229Е (СИ Додатак, слика С2), што се показало потребним за активност НиРАН и репликацију ХЦоВ-229Е (Слике 3Д и Е).Овај остатак такође одговара остатку артеријског вируса ЕАВ нсп9 К94, за који се раније показало да је неопходан за само-УМПилацију/само-ГМПилацију НиРАН (16).Као што је приказано на слици 6Б, САРС-ЦоВ-2 нсп12 има активност УМП трансферазе користећи нсп9 као супстрат, док је мутант активног места нсп12_К4465А неактиван.Двострука супституција у СДД карактеристичној секвенци РдРп мотива Ц не утиче на активност УМП трансферазе (слика 6Б), што указује да активност РдРп нема директан ефекат у нсп9 УМПилацији.Слични подаци су добијени коришћењем ЦТП, ГТП и АТП (СИ додатак, слика С10).Укратко, ови подаци указују да нсп9 НМПилација посредована НиРАН-ом има конзервативну активност у коронавирусима који представљају различите родове подфамилије ортокорона вируса.
НМПилација нсп9 посредована САРС-ЦоВ-2 нсп12.(А) Цоомассие обојен СДС-полиакриламид гел који показује рекомбинантни протеин који се користи у тесту НМПилације.Као контрола, коришћен је мутантни протеин са супституцијом активног места у домену НиРАН (К4465А) и РдРп домену (ДД5152/3АА) САРС-ЦоВ-2 нсп12.Нумерација остатака је заснована на позицији у пп1аб.(Б) Ауторадиограф детекције УМПилације користећи нсп9-Хис6 и [α-32П]УТП као супстрат нсп12-Хис6 (дивљи тип [вт] и мутант).Молекуларна маса (у килодалтонима) обележеног протеина је приказана на левој страни.
НиРАН домени су генерално конзервирани у Нидовиралес (16), што указује да катализују ензимске реакције неопходне за репликацију Нидовируса.У овој студији, успели смо да докажемо да НиРАН домен коронавируса преноси НМП (генерисан из НТП) на нсп9, мистериозни РНК везујући протеин укључен у репликацију вируса (26 ?? 29), да бисмо га одредили као природну мету и партнер цоронавирус РТЦ.
НиРАН домен дели три мотива секвенце (АН, БН и ЦН), који садрже веома мали број остатака који су конзервирани у свим породицама у монофилетском, али високо диференцираном реду Нидовиралес (8, 16).Недавне студије су показале да су они структурно повезани са у великој мери неокарактерисаном фамилијом протеина сличних протеин кинази, који су првобитно названи СелО фамилија (17, 19, 22, 30, 31).Протеини повезани са СелО имају наборе киназе, али им недостаје неколико конзервираних остатака активног места у класичним киназама (22, 32).На основу обрнуте оријентације АТП молекула везаних за активно место и стабилизованих специфичним интеракцијама, за СелО је претпостављено и накнадно потврђено да преноси АМП (уместо фосфата) на протеински супстрат (22), док други бактеријски протеин сличан СелО-у има ИдиУ недавно је показано да катализује ковалентно везивање УМП за Тир и Хис остатке различитих протеинских супстрата (33).
Да бисмо потврдили и проширили предвиђање наводних остатака активног места НиРАН домена коронавируса, користили смо биохемијске и реверзне генетичке методе да извршимо анализу мутације на коронавирусу нсп12 (слика 3Д и Е и СИ додатак, слика С3 и табела) С1а С4).Подаци показују да замена ХЦоВ-229Е К4135, Р4178 и Д4280 са Ала елиминише ин витро активност НМП трансферазе и репликацију вируса у ћелијској култури (слика 3Д и Е и СИ додаци, слика С3), подржавајући њихово присуство у НТП γ-фосфату (К4135, Р4178) и координација јона метала активног места (Д4280).Показало се да је замена Е4145А очуваног Глу у опсегу вируса птичјег гнезда за који је предвиђено да стабилизује положај К4135 (17) елиминисала репликацију вируса, али изненађујуће, активност је задржана у ин витро тесту НМПилације (Слика 3Д и Е и СИ додатак, слика С3 и табеле С1–С4).Слично запажање је учињено када је одговарајућа супституција уведена у ИдиУ хомолог Салмонелла типхимуриум (Е130А) (33).Узети заједно, ови подаци подржавају регулаторну функцију овог конзервираног остатка, а не каталитичку функцију.
Замена конзервираног Пхе остатка (Ф4281А) у опсегу нестовируса у ХЦоВ-229Е НиРАН домену (8) је резултирала смањењем активности НМПилације ин витро и значајним смањењем репликације вируса у ћелијској култури (Слика 3Д, Е и СИ) додатак, слика С3).Подаци су у складу са важном регулаторном функцијом овог остатка, као што је хомологни ДФГ мотив Пхе остатак приказан раније.У класичним протеин киназама, он је део везне петље Мг2+ и помаже у склапању и регулацији кичме???Потребан за ефикасну каталитичку активност (32, 34).Замена Ала и Арг за остатке К4116 (у преАН мотиву), респективно, елиминисала је репликацију вируса и, како се очекивало, имала је различите ефекте на активност НМП трансферазе ин витро, у зависности од уведеног бочног ланца аминокиселина (Слика 3Д и Е и СИ додаци , Слика С3).Функционални подаци су у складу са структурним информацијама, што указује да је овај остатак успоставио интеракцију са АТП фосфатом (17).У домену НиРАН других угнежђених породица вируса, положај ХЦоВ-229Е пп1а/пп1аб К4116 заузима Лис, Арг или Хис (8), што указује да је функционално ограничење овог специфичног остатка опуштено.Замена Д4188А и Д4283А елиминише или снажно смањује активност ензима и елиминише репликацију вируса (Слика 3).Ова два остатка су сачувана у већини (али не у свим) угнежђеним вирусима (8), што указује на важну функцију специфичну за породицу, али можда и некаталитичку функцију.Ала супституције неколико других Лис и Асп остатака (К4113А, Д4180А, Д4197А и Д4273А) које нису конзервиране у Цоронавиридае или другим породицама Нестиовиридае (8) коришћене су као контроле.Као што се и очекивало, ове замене су углавном подношљиве, са благим смањењем активности ензима и репликације вируса у неким случајевима (слика 3 и СИ додатак, слика С3).Све у свему, подаци о мутагенези коронавируса су веома конзистентни са подацима о само-ГМП и реверзној генетици ЕАВ НиРАН-РдРп (16), у којима ЕАВ нсп9 (цоронавирус нсп12 ортхолог) остатак К94 (одговара ХЦоВ-229Е К4135) важне функције), Р124 (одговара Р4178), Д132 (одговара Д4188), Д165 (одговара Д4280), Ф166 (одговара Ф4281).Поред тога, подаци о мутагенези ХЦоВ-229Е су у складу и проширени из претходно пријављених података о реверзној генетици САРС-ЦоВ (16), исто толико слични онима који су уочени за одговарајући ЦН мотив Пхе-то-Ала мутант САРС-ЦоВ_нсп12. описани фенотип -Ф219А и ХЦоВ-229Е_Ф4281А (Слика 3 Д и Е и СИ додатак, Слика С3 и Табела С1-С4).
У поређењу са ЕАВ ортолозима (16), који имају јасну предност за УТП и ГТП (у реакцији само-НМПилације), наша студија показује да домен НиРАН коронавируса (који представљају ХЦоВ-229Е и САРС-ЦоВ-2) може ефикасно пренео Сва четири НМП-а, иако постоји мала преференција за УМП (Слике 1 и 3).Релативно ниска специфичност специфичног НТП косупстрата је у складу са недавно објављеном суперкомпозитном структуром САРС-ЦоВ-2 нсп7/8/12/13, у којој се АДП-Мг2+ везује за активно место НиРАН-а, али не и за део аденина. формирања специфичних интеракција (17).У нашој студији, тип нуклеотида који се користи у реакцији НМПилације нема диференцијални ефекат на активност мутантног протеина (СИ додатак, слика С3), што указује да ниједан од ових остатака није блиско повезан са везивањем специфичне нуклеобазе.Остаје да се проучи структурна основа и потенцијални биолошки значај различитих преференција НТП ко-супстрата уочених у НиРАН доменима коронавируса и артеријских вируса;могу бити истините или могу бити последица ограничења њихових студија.Тренутно се не може искључити да потенцијална активност НМПилатор-а НиРАН домена артеријског вируса (у поређењу са претходно окарактерисаном активношћу само-НМПилације) има другачију преференцију ко-супстрата, узимајући у обзир да је сличност између артеријског и корона вируса НиРАН домен је на граници.Поређење засновано на секвенци (16).У поређењу са псеудокиназом СелО, која користи Мг2+ као кофактор, активност коронавируса и артеријског вируса НиРАН зависи од Мн2+ (16) (Слика 3Ц и СИ додатак, Слика С1).Зависност од Мн2+ и очигледна преференција за УТП је необична карактеристика протеинских НМПилатора, и тек је недавно потврђена у ИдиУ протеину Салмонелла типхимуриум, који катализује стриктно Мн2+-зависну протеинску шаперону УМПилацију како би заштитила ћелије од индукције стреса. 33).
Недавно описана структурна сличност између домена НиРАН коронавируса и ћелијских протеин киназа (17, 19) пружа додатну подршку способности НиРАН-а да ковалентно повеже НМП са другим протеинима које смо известили у овој студији.Фокусирали смо нашу потрагу за могућим НиРАН циљевима на протеине које кодира ХЦоВ-229Е ОРФ1а, за које се зна да директно или индиректно помажу репликази кодираној у РТЦ-у ОРФ1б (12, 35).Наши експерименти пружају убедљиве доказе за ефикасну и специфичну НМПилацију нсп9 (Слика 2).Ако се циљни протеин користи у моларном вишку који је 8 до 10 пута већи од ензима (нсп12), потврђује се да је нсп9 потпуно (моно)НМПизован (слика 4).Закључили смо да је интеракција између нсп12 и нсп9 краткотрајна и да неће формирати стабилан комплекс са нсп9 (у одсуству других РТЦ подјединица).Овај закључак поткрепљују студије интеракције протеина на САРС-ЦоВ протеому (35).МС анализа је идентификовала примарни амин Н-терминалног остатка нсп9 као место НМПилације (СИ додатак, Слика С5).Формирање фосфорамидатне везе и Н-терминалне амино групе разликује активност НМПилације посредовану НиРАН-ом од реакције АМПилације посредоване Псеудомонас сирингае СелО, која катализује формирање О-везаног АМП на Сер, Тхр или Тир остацима Пептидни адукт ( 22), а С. типхимуриум ИдиУ формира О-везане (са Тир) и Н-везане (са Хис) пептидне-УМП адукте.Ограничене информације доступне о СелО породици протеина указују на то да се чланови ове велике породице протеина у великој мери разликују у формирању пептидних-НМП адуката.Ово је занимљиво запажање које заслужује даље проучавање.
Подаци добијени у овој студији навели су нас да претпоставимо да је за НМПилацију нсп9 потребан слободан Н-терминус.У контексту репликације вируса, ово ће бити обезбеђено протеолитичким цепањем места за обраду нсп8|нсп9 у полипротеину репликазе пп1а посредованом Мпро и пп1аб.У већини коронавируса, разлика између овог специфичног места (ВКЛК|ННЕИ у ХЦоВ-229Е) и свих других места цепања Мпро коронавируса је да Асн (уместо другог малог остатка, као што је Ала, Сер или Гли) заузима П1а???Локација (36).Подаци о цепљењу пептида добијени у раним студијама показали су да је ефикасност цепања нсп8|нсп9 места била нижа од оне на другим местима, што указује да 1) ово специфично место може имати регулаторну улогу у благовременом координисаном процесуирању Ц-терминала пп1а регион, или 2) а Улога посебно очуваног нсп9 Н-краја у репликацији вируса (37).Наши подаци (Слика 5А) су показали да је рекомбинантни облик нсп9 који носи стварну Н-терминалну секвенцу ефикасно НМПизовао нсп12.Н-терминална бочна секвенца је уклоњена фактором Кса (нсп9-Хис6; СИ додатак, Табела С1) или Мпро-посредованим цепањем (нсп7-11-Хис6; Слика 5А и СИ додатак, Табела С1).Важно је да је непресечени прекурсор нсп7-11-Хис6 који садржи нсп9 показао отпорност на НМПилацију нсп12, што је у складу са нашим подацима, што указује да се адукт нсп9-НМП формира преко Н-терминалног примарног амина (СИ додатак, слика С5) .Да бисмо стекли дубље разумевање специфичности НиРАН супстрата, затим смо се фокусирали на суседне Н-терминалне остатке нсп9.У недостатку других протеина, они су структурно флексибилни, спречавајући их да буду откривени у необележеном облику нсп9 (26 28, 38), што указује на њихову ограничену природну варијацију. Ово је због важне секвенце специфичне (не повезане са секундарном структуром) функција нсп9 Н-терминалног фрагмента.Ала супституције конзервираних остатака у овом региону (Слике 5Ц и Д и СИ додатак, Слика С8) откривају да је Н3826 неопходан за нсп9 НМПилацију ин витро, док Н3825А и Е3827А супституције доводе до смањења НМПилације, док М3829А и П38 нису супституције .Очигледно утиче на нсп9 НМПилатион.Иако замена Н-терминалног Асн (Н3825А, Н3825С) има само умерен ефекат на нсп9 НМПилацију и репликацију вируса у ћелијској култури (Слике 5Ц и Д), брисање секвенце Асн остатка из Н-терминалног 3825-НН дипептида показало се да је смртоносан за вирусе, што указује да је један остатак Асн потребан пре другог остатка на Н-крају, пожељно Асн, иако се чини да се замена сличних остатака може делимично толерисати (Слика 5Б, Ц и Д).Закључујемо да 3825-НН дипептид, посебно конзервирани и есенцијални остатак Н3826 у опсегу коронавируса (СИ додатак, слика С6), обезбеђује исправно везивање и оријентацију нсп9 Н-краја у активном месту НиРАН.
Замена Ала (Е3827А) за конзервирани Глу свих потфамилија задржава нсп9 НМПилацију ин витро, али је смртоносна за вирусе у ћелијској култури (Слика 5Ц и Д), што указује на додатну функцију овог остатка, на пример, у кључним интеракцијама (НМПилирани или немодификовани ) нсп9 Н-терминус и други фактори укључени у репликацију вируса.Нсп9 мутације нису утицале на протеолитички процес нсп9 или било који суседни нспс (39) (СИ додатак, слика С9), што указује да смртоносни фенотипови неколико уочених мутација нсп9 нису узроковани дисрегулацијом Ц протеолитичког процеса-терминалног пп1а подручја .
Горе наведени подаци пружају доказ да након Мпро-посредованог третмана места цепања нсп8|9 у пп1а/пп1аб, Н-терминус нсп9 може бити УМПилован (или делимично модификован другим НМП).Поред тога, одлична конзервација Н-краја нсп9 (укључујући сингуларне и инваријантне Асн остатке у породици коронавируса) и подаци о обрнутој генетици добијени у овој студији (слике 3Е и 5Д) довели су нас до закључка да је описана нсп9 НМПилација је биолошки повезан и неопходан за репликацију коронавируса.Остаје да се проуче функционалне последице ове модификације, на пример, у вези са претходно описаном (неспецифичном) нсп9 (немодификованим обликом) везивном активношћу РНК (2628).Н-терминална НМПилација такође може утицати на интеракцију нсп9 са протеинским или РНК супстратима или на формирање различитих склопова на четири нивоа.Они су уочени у структуралним студијама и потврђено је да су функционално повезани са репликацијом коронавируса, иако посебно у одсуству У случају ове модификације (26-аа29, 40).
Иако циљну специфичност НиРАН домена коронавируса још увек треба детаљније окарактерисати, наши подаци показују да је специфичност циља протеина НиРАН домена коронавируса веома уска.Иако очување кључних остатака активног места (8, 16) у домену НиРАН свих фамилија нидовируса снажно подржава активност конзервираних НМПилатор ових протеина, идентитет џепних остатака овог домена који се везују за супстрат остаје да се окарактерише. , и могу се разликовати између различитих породица Нидовиралес намена.Слично томе, релевантне мете других угнежђених вируса тек треба да буду одређене.Они могу бити удаљени ортолози нсп9 или других протеина, јер су секвенце изван пет домена репликазе које су генерално очуване у угнежђеним вирусима мање очуване (8), укључујући низ генома између Мпро и НиРАН. Међу њима, нсп9 се налази у вирус корона.
Поред тога, тренутно не можемо искључити могућност да НиРАН домен има додатне (укључујући ћелијске) мете.У овом случају, вреди напоменути да се чини да бактеријски хомолози у овом новом протеину НМПилаторс (НМПилаторс) (30, 31) имају „главне регулаторе“?НМП модулира различите ћелијске протеине да регулише или елиминише њихове низводне активности, играјући на тај начин улогу у различитим биолошким процесима, као што су ћелијски одговор на стрес и редокс хомеостаза (22, 33).
У овој студији (слике 2 и 4 и СИ додатак, слике С3 и С5), успели смо да докажемо да је нсп12 пренео део УМП (НМП) на једну (конзервирану) позицију у нсп9, док други протеини нису били модификовани у Користи се Под овим условима, подржана је добро дефинисана (а не лабава) специфичност супстрата.У складу са овим, у поређењу са Н-терминалном нсп9 НМПилацијом, сопствена НМПилациона активност нсп12 је веома ниска, њено откривање захтева дуже време излагања ауторадиографији, а користи се 10 пута повећање концентрације нсп12.Поред тога, наша МС анализа није успела да пружи доказе за НМПилацију нсп12, што сугерише да је само-НМПилација НиРАН домена (у најбољем случају) секундарна активност.Међутим, треба напоменути да су друге студије пружиле прелиминарне доказе да статус само-АМПилације бактеријског НМПилатор-а може контролисати њихову активност НМПилације на другим протеинским супстратима (22, 33).Стога је потребно више истраживања да би се истражили могући функционални ефекти активности само-НМПилације пријављених за ЕАВ нсп9 (16) и коронавирус нсп12 (ова студија), укључујући предложени ефекат сличан шаперону на савијање Ц-терминалног РдРп домена ( 16) ).
Раније је размотрено неколико хипотеза у вези са могућим низводним функцијама нидовиралног НиРАН домена, укључујући РНК лигазу, РНК-капирану гванилат трансферазу и активност прајминга протеина (16), али ниједна од њих није компатибилна са доступним низводним функцијама.Информације добијене на следећим позицијама су потпуно исто време без додатних претпоставки.Подаци добијени у овој студији су најконзистентнији са (али не могу доказати) да је НиРАН домен укључен у иницијацију протеином индуковане РНК синтезе.Раније се веровало да је функција НиРАН домена у 5??²-РНА затварање или реакције лигације РНК нису под утицајем ових и Подршка других података.Стога, на пример, сматра се да активно место НиРАН укључује конзервирани Асп као општу базу (Д252 у Псеудомонас сирингае СелО; Д4271 у ХЦоВ-229Е пп1аб; Д208 у САРС-ЦоВ-2 нсп12) (СИ Додатак, слика 2 ).С2) (17, 22, 33), док се катализа у АТП-зависној РНК лигази и ензиму за затварање РНК врши ковалентним ензимом (лизил-Н)-НМП интермедијером, који укључује непромењени Лис остатак ( 41).Поред тога, изузетна специфичност НиРАН коронавируса заснована на секвенци за конзервиране протеинске мете и опуштена специфичност за НТП ко-супстрате (преферира УТП) супротставља се НиРАН-посредованом ензиму за затварање или функцијама сличним РНК лигази.
Очигледно, потребно је много додатног рада да би се верификовало и, ако се докаже, разрадила могућа улога нсп9-УМП (нсп9-НМП) у синтези РНК индуковане протеинима, што ће повезати неколико интересантних, али (до сада) извештаја о којима смо раније извештавали .Изолована запажања.На пример, утврђено је да крај РНК негативног ланца коронавируса почиње са олиго(У) ланцем (42, 43).Ово запажање је у складу са идејом да се синтеза РНК негативног ланца иницира везивањем УМПилованог облика нсп9 за поли(А) реп (окидаче), који може бити подстакнут његовим везивањем РНК. Активност и/или интеракција са још један РТЦ протеин.УМП део који обезбеђује нсп9 може се затим користити као „прајмер“ за олигуридилацију посредовану нсп7/8/нсп12, користећи 3??²-поли(А) реп у геномској РНК или другу секвенцу која садржи олиго (А) служи као шаблон, сличан механизму установљеном за ВПг протеин пикорнавируса (44).Шта ако је предлог „ненормативан”????Покретање (протеин-индуковане) синтезе РНК негативног ланца пружа везу са запажањима, што указује да РНК негативног ланца коронавируса има УМП (уместо УТП) на свом крају (42), што се сматра да указује на то да нуклеинска киселина Дицер цепа крај фосфорилисан непознатом ендонуклеазом специфичном за уридин.Ако се потврди, ова хидролитичка активност нуклеинске киселине може помоћи у ослобађању олигомерног УМПилованог облика нсп9 са 5 ² краја негативног ланца у настајању.Могућа улога нсп9 у прајмингу протеина је такође у складу са претходним студијама реверзне генетике, које су показале да нсп9 (и нсп8) реагују критички и специфично са очуваним цис-делујућим РНК елементом близу трећег краја генома коронавируса.45).Према овом извештају, ова претходна запажања сада могу бити преиспитана и проширена кроз даља истраживања.
Укратко, наши подаци су утврдили специфичну активност власничке угнежђене ензимске ознаке вируса повезане са РдРп на Н-крају.Код коронавируса, ова новооткривена УМПилатор/НМПилатор активност посредована НиРАН-ом се користи да се ослања на Мн2+ и суседне Асн остатке и изазива формирање (нискоенергетских) фосфорамидатних веза са Н-терминалним примарним амином.Кроз Мпро-посредовано цепање на месту цепања нсп8|9, циљ нсп9 се може користити за НМПилацију, што указује на функционално спајање између протеазе и НиРАН домена, које се протеже до РдРп.Очување кључних остатака у активном месту нсп12 НиРАН и мети нсп9, у комбинацији са подацима добијеним од два коронавируса укључујући САРС-ЦоВ-2, пружа јак доказ да је нсп9 НМПилација коронавирус. Конзервативне карактеристике су такође кључни корак у репликацији вируса.Доступни подаци наводе нас на закључак да је специфична улога НМПилираног облика нсп9 у синтези РНК индуковане протеинима разуман сценарио за коронавирус и друге угнежђене вирусе, а НиРАН такође може да циља друге неидентификоване протеине.Регулишите вирус.Интеракција домаћина.Ако се потврди, учешће протеинских прајмера у синтези вирусне РНК повећаће афинитет секвенце Мпро/3ЦЛпро и РдРп домена између претходно откривених коронавируса и супергрупе сличне пикорнавирусу (9), које су сада обједињене у недавно успостављеним Писонивиритима ( 46) у категорији.
Наши подаци такође показују да се основне, селективне и конзервативне ензимске активности идентификоване у овој студији могу користити као мете за антивирусне лекове.Једињења која ометају везивање (и накнадну модификацију) очуваног нсп9 Н-краја у активном месту НиРАН-а могу се развити у ефикасне и разноврсне антивирусне лекове, погодне за лечење животињских и људских коронавируса из различитих (под)рода инфекција , укључујући САРС-ЦоВ-2 и блискоисточни респираторни синдром коронавирус.
Кодирајућа секвенца протеина коронавируса произведеног у овој студији је амплификована РТ-ПЦР коришћењем РНК изоловане из Хух-7 инфициране са ХЦоВ-229Е или Веро Е6 инфицираног са САРС-ЦоВ-2, и убачена коришћењем стандардних процедура клонирања.пМАЛ-ц2 (Нев Енгланд Биологицал Лаборатори) или пАСК3-Уб-ЦХис6 (47) експресиони вектор (СИ Додатак, табеле С1 и С2).Појединачне супституције кодона уведене су мутагенезом усмереном на место заснованом на ПЦР-у (48).Да би се произвео МБП фузиони протеин, Е. цоли ТБ1 ћелије су трансформисане одговарајућим пМАЛ-ц2 плазмидним конструктом (СИ додатак, Табела С1).Фузиони протеин је пречишћен хроматографијом афинитета амилозе и цепан фактором Кса.Након тога, протеин обележен са Хис6 са Ц-терминала је пречишћен Ни-имобилизованом металном афинитетном хроматографијом (Ни-ИМАЦ) као што је претходно описано (49).Да би произвеле убиквитин фузиони протеин, ћелије Е. цоли ТБ1 су користиле одговарајућу плазмидну конструкцију пАСК3-Уб-ЦХис6 (СИ додатак, табеле С1 и С2) и пЦГИ плазмидну ДНК која кодира за убиквитин специфичну Ц-терминалну хидролазу 1 (Убп1).Трансформација (47).Ц-терминални Хис6-означени протеин коронавируса је пречишћен као што је претходно описано (50).
Тест само-НМПилације ХЦоВ-229Е нсп12-Хис6 изведен је као што је описано у ЕАВ нсп9 (16).Укратко, нсп12-Хис6 (0,5 µМ) садржи 50 мМ 4-(2-хидроксиетил)-1-пиперазинетансулфонске киселине (ХЕПЕС)-КОХ, пХ 8,0, 5 мМ дитиотреитола (ДТТ), 6 мМ МнЦл2, мМ МнЦл2, µМ пуфера специфицирани НТП и 0,17 µМ су одговарали [α32-П]НТП (3,000 Ци/ммол; Хартманн Аналитиц) на 30 °Ц током 30 минута.У свим осталим (стандардним) тестовима НМПилације нсп9 НМПилације посредоване нсп12, реакциони услови су подешени на следећи начин: нсп12-Хис6 (0,05 µМ) и нсп9-Хис6 (4 µМ) у присуству 50 мМ ХЕПЕС-КОХ (пХ 8). ), 5 мМ ДТТ, 1 мМ МнЦл2, 25 µМ указује на НТП, а 0,17 µМ одговара [α32-П]НТП.Након инкубације од 10 минута на 30°Ц, реакциони узорак је помешан са СДС-ПАГЕ пуфером за узорке: 62,5 мМ трис(хидроксиметил)аминометан ХЦл (пХ 6,8), 100 мМ ДТТ, 2,5% СДС, 10% глицерола и 0,005% бромофенола. Плави.Протеин је денатурисан загревањем на 90 °Ц током 5 минута и одвојен са 12% СДС-ПАГЕ.Гел је фиксиран и обојен раствором Цоомассие Бриллиант Блуе (40% метанола, 10% сирћетне киселине, 0,05% Цоомассие Бриллиант Блуе Р-250), обезбојен и изложен фосфоресцентном екрану за снимање током 20 сати (да би се открио нсп12 од НМПилације) или (максимално) 2 сата (за процену нсп9 НМПилације).За скенирање екрана коришћен је уређај за снимање Типхоон 9200 (ГЕ Хеалтхцаре), а за анализу интензитета сигнала коришћен је ИмагеЈ.
За МС анализу, 1 µМ нсп12-Хис6 и 10 µМ нсп9 (без хексахистидинске ознаке) коришћени су у анализи НМПилације (СИ додатак, Табела С1) и коришћена је повећана концентрација од 500 µМ УТП и ГТП.У зависности од њихове концентрације и очекиваног квалитета протеина, ХПЛЦ систем Ватерс АЦКУИТИ Х-класе опремљен колоном МассПреп (Ватерс) је коришћен за одслађивање 1 до 10 µЛ пуферованих протеинских раствора на мрежи.Осољени протеин се елуира у извор јона за електроспреј Синапт Г2Си масеног спектрометра (Ватерс) кроз следећи градијент пуфера А (вода/0,05% мравља киселина) и пуфера Б (ацетонитрил/0,045% мравља киселина), а температура колоне је 60 °Ц и брзина протока од 0,1 мЛ/мин: елуирање изократично са 5% А током 2 минута, затим линеарни градијент до 95% Б у року од 8 минута, и одржавање 95% Б још 4 минута.
Детектују се позитивни јони са опсегом масе од 500 до 5000 м/з.Глу-фибринопептид Б се мери сваких 45 секунди ради аутоматске корекције одступања масе.Користите софтвер за инструменте МассЛинк са екстензијом МакЕнт1 да бисте деконволвирали просечни спектар након одузимања основне линије и изравнавања.
УМПиловани ХЦоВ-229Е нсп9 је дигестиран додавањем модификованог трипсина (Серва) и инкубиран преко ноћи на 37 °Ц.Цхромабонд Ц18ВП спин колона (број дела 730522; Мацхереи-Нагел) је коришћена за одслађивање и концентрисање пептида.Коначно, пептид је растворен у 25 уЛ воде, која је садржала 5% ацетонитрила и 0,1% мравље киселине.
Узорци су анализирани помоћу МС помоћу Орбитрап Велос Про масеног спектрометра (Тхермо Сциентифиц).Врхунски наноа ХПЛЦ систем (Дионек), опремљен са прилагођеним 50 цм монтираним на крају?75 μм Ц18 РП колона са 2,4 μм магнетним перлама (Др. Албин Маисцх Хигх Перформанце ЛЦ ГмбХ) Повежите се са масеним спектрометром на мрежи преко Прокеон извора наноспреја;убризгати 6 µЛ раствора за варење трипсина у унутрашњи пречник од 300 µм ×??1 цм Ц18 ПепМап колона за предконцентрацију (Тхермо Сциентифиц).Коришћењем воде/0,05% мравље киселине као растварача, узорак је аутоматски заробљен и десалинизован при брзини протока од 6 µЛ/мин.
Следећи градијенти вода/0,05% мравље киселине (растварач А) и 80% ацетонитрила/0,045% мравље киселине (растварач Б) су коришћени да би се постигло одвајање триптичних пептида при брзини протока од 300 нЛ/мин: 4% Б за 5 минута, затим 30 А линеарни градијент до 45% Б у року од неколико минута, и линеарни пораст до 95% растварача Б у року од 5 минута.Повежите хроматографску колону са наноемитером од нерђајућег челика (Прокеон) и распршите елуент директно на загрејану капилару масеног спектрометра користећи потенцијал од 2.300 В. Скенирање анкете са резолуцијом од 60.000 у Орбитрап масеном анализатору је повезано са најмање три МС/МС скенирања података, динамички искључена у трајању од 30 секунди, користећи дисоцијацију изазвану сударом са линеарним хватањем јона или дисоцијацију судара веће енергије у комбинацији са детекцијом орбитрапа, Резолуција је 7,500.
Време поста: 03.08.2021